مدير معهد أمراض النبات الاسبق وعضو لجنة مبيدات الآفات الزراعية

أهمية التعريف الدقيق للميكروبات

تختلف الميكروبات عن بعضها في احتياجاتها الغذائية و البيئية و سلوكها من حيث التطفل و الترمم علي الكائنات المختلفة او كونها تستطيع ان تعيش معيشة حرة . لذلك منذ اكتشاف الميكروبات بعد اكتشاف الميكروسكوب عكف العلماء علي تصنيف هذه الميكروبات حتي يسهل دراستها و التعامل معها و الاستفادة بها و الحذر منها . و لكن بزيادة الميكروبات المعرفة اصبحت تعريف الميكروبات عملية صعبة تحتاج الي جهد كبير و خبرة عالية للقائم عليها .

الا ان التقدم التكنولوجي و زيادة المعلومات المتوفرة عن هذه الكائنات مكنت بعض الهيئات العلمية و الشركات من ابتكار أنظمة جديدة تكون اكثر دقة ، سهلة التطبيق ، سريعة النتائج .

احد هذه الانظمة هو نظام Microlog System المعروف بأسم البيولوج و هو نظام يعتمد علي مدي استفادة الميكروب الذي يتم تعريفة بهذه الطريقة من مصادر الكربون و النيتروجين والليبدات المختلفة و التي تتحول الي تغير في اللون و يعطي أرقام يتم قراءتها بواسطة جهاز القارئ Microstation reader و بواسطة المعلومات المخزنة ( قاعدة البيانات )علي جهاز الكمبيوتر الخاص بالبيولوج يتم التعريف الدقيق للميكروبات .

ان نظام البيولوج يعتبر وسيلة متقدمة و حديثة و سهلة لتعريف و تمييز الكائنات الدقيقة . حيث ان قاعدة البيانات تشمل اكثر من 1900 نوع من البكتيريا الهوائية ، اللاهوائية و الفطريات و الخمائر و هي تشمل معظم الانواع الهامة المستخدمة في مجالات الطب ، الصيدلة ، التكنولوجيا الهوائية ، الزراعة و كذلك العلوم البيئية .
و يعتمد نظام البيولوج علي استهلاك 95 مصدر كربوني و احماض امينية و ليبدات مختلفة موجودة في اطباق البيولوج و نتيجة استهلاك المصادر المختلفة و التي تعتمد علي نوع الميكروب و قدرتة علي استهلاك المصادر فانه يعطي نمط وحيد لكل ميكروب يسمي Finger print .
حيث انه بمجرد البدء في استهلاك مصادر الكربون فانه يبدأ في التنفس و نتيجة عملية التنفس يحدث اختزال لصبغة التترازوليم و يحدث تغير في اللون في الwells المختلفة الي اللون القرنفلي . و النتيجة النهائية لحدوث التغير في اللون و التنفس يعطي صفة مميزة للكائنات الدقيقة و تسمي بصمة تنفسية
و بالنسبة للفطريات فان يحدث نوعين من التغير الذي يتم قراءتة علي الجهاز و هو عبارة عن نوعين من التغيرات احدهما تغير الي اللون البرتقالي و يرجع الي حدوث التنفس و اختزال لون الصبغة ، و التغير الاخر عبارة عن عكارة نتيجة النمو و الذي يتم تحديدة في الwells

الدليل العملي و النظري لاستخدام نظام البيولوج في تعريف الكائنات الحية الدقيقة :

كما هو الحال في اي طريقة لتعريف الكائنات الحية الدقيقة فان دقة النتائج تعتمد علي التحضير الجيد للعينات .

و لذلك فان نظام التعريف باستخدام البيولوج يتطلب :

1- استخدام الطرق المعملية المناسبة حيث ان استخدام الطرق الغير مناسبة يؤدي الي ظهور كثير من مشكلات التعريف
2- استخدام البيئات الملائمة و ظروف التعقيم الجيدة حيث انها تؤدي الي زيادة فرصة تعريف الميكروبات بدون مشاكل
3- حيث ان تطوير قاعدة البيانات الخاصة بنظام البيولوج يعتمد علي وجة الخصوص علي استخدام البيئة الخاصة بالبيولوج و التي تم اختيارها بعناية ، حيث ان البيئات الغير متخصصة تؤدي الي تغير في الصفات الطبيعية للميكروبات و لكي يعمل نظام التعريف بكفاءة عالية فان يتطلب نمو غزير و كفاءة تمثيلية عالية و التي لن تتوفر الا بأستخدام بيئة البيولوج المتخصصة .

و لكي يتم التعرف لابد من اتباع الخطوات التالية:

1- عزل مزرعة نقية :

– تتم زراعة المزرعة المراد تعريفها علي بيئة البيولوج المتخصصة:
• جميع الانواع البكتيرية الموجودة في قاعدة البيانات الخاصة بالبيولوج تنمي علي بيئة البيولوج Biolog Universal Growth Media ( BUA او BUG ) و ذلك بوجة عام ، الا في بعض الحالات يضاف 5% دم ماعز او سكر مالتوز.
• يتم تنمية الخمائر علي بيئة BUY
• في حاله الفطريات يتم تنميتها علي بيئة اجار مستخلص الشعير2%

– يجب التأكد من انك تحصل علي مزرعة نقية
– يتم تحضين العزلات في درجة الحرارة النموذجية ( المثالية ) معظم البكتيريا لابد ان تنمو علي درجة حرارة 35-37 ºم او 30ºم حسب النوع البكتيري ( بعض الانواع البكتيرية الموجبة لجرام و اللاهوائية تنمو علي درجة حرارة 26ºم ) في حين ان الفطريات الخيطية و الخمائر تنموعلي درجة حرارة 26ºم .
– لا تترك المزارع تنمو لفترات طويلة . حيث ان اقصي نمو لمعظم الانواع البكتيرية حوالي 24 ساعة ، 72 ساعة للخمائر ، 10 ايام بالنسبة لمعظم الفطريات . مع استثناء لبعض انواع البكتيريا البطيئة النمو Fastidious bacteria قد تتطلب 48 ساعة للنمو او استخدام اكثر من طبق للنمو . و بوجة عام لابد ان تكون العزلات البكتيرية نقية ، متجانسة في الشكل و اللون

2- صبغ الخلايا البكتيرية :
ان صبغ الخلايا البكتيرية للتعرف علي النوع البكتيري ضرورى لاختيار البيئة المناسبة و نوع الاطباق Microplates المستخدمة .
و لابد من الاجابة علي بعض الاسئلة :
o هل الميكروب بكتيري ام خميرة ؟
o هل الميكروب ( في حالة البكتيريا ) موجبة لجرام ام سالبة لجرام ؟
o هل الخلايا البكتيرية عصويه ام كروية ؟
o هل الخلايا البكتيرية من النوع المكون للجراثيم ؟
يمكن استخدام التحضير المائي لو كان الميكروب خميرةاو فطر .

في حالة تحديد نوع البكتيريا السالبة لجرام :
– هناك عدة اختبارات اضافية لتحديد ما اذا كان الميكروب ( non entric – او entric – او Fastidous )
– . لابد من عمل اختبار الاكسدة Oxidase test – لو كان اختبار الاكسدة موجب فان الميكروب يكون non-entric لو كان اختبار الاكسدة سالب و البكتيريا تكون مستعمرات كبيرة فان البكتيريا من المحتمل ان تكون entric

في حالة البكتيريا الموجبة لجرام يجب تحديد ما اذا كانت كروية او عصوية . فان كانت عصوية لابد من تحديد ما اذا كان الميكروب يكون جراثيم ام لا . حيث ان البكتيريا المكونة للجراثيم لها طرق خاصة في الاتبارات حيث ان لابد ايضا من عمل اختبار ال Catalase test

في حالة البكتيريا اللاهوائية – العصوية لابد من عمل اختبارات اضافية مثل عمل اختبار Kanamycin disk test

في حالة الفطريات الخيطية و الخمائر- لابد من تحديد نوع العزلة اولا :
– air data base و تشمل معظم الفطريات و الخمائر المعزولة من الهواء .
– food data base و تشمل معظم انواع الفطريات و الخمائر المعزولة من الغذاء .
– Yeast data base و تشمل عدد محدد من الخمائر .
– و توجد قاعدة بيانات لكل من فطريات Aspergillus, Colletotrichum , Fusarium , Pencillium , Trichoderma .

3- زراعة المزرعة المراد تعريفها :

– لابد من استخدام البيئة المناسبة
– انتقاء مستعمرات فردية نقية
– يتم تحضين معظم الميكروبات لمدة 16-24 ساعة – في حالة الانواع بطيئة النمو جيدا و الخمائر فانها تحتاج 48 ساعة – انواع البكتيريا البطيئة النمو تحتاج اطول فترة تحضين – في حالة الفطريات فانها تحتاج من 5-10 يوم و الفطريات لبطيئة النمو تحتاج لفترات تحضين اكبر لحدوث التجرثم .

4- تحضير اللقاح :
– يتم تحضير معلق من الميكروب المراد تعريفة
– لابد من قياس مدي عكارة المعلق و معايرتة المعلقات القياسية المرفقة مع الجهاز
– لابد ان يكون المعلق متجانس التوزيع – في حالة ما اذا كانت البكتيريا تكون تكتلات فان لها طرق معملية اخري .
– في بعض الحالات يتم اضافة Thioglycolate للمعلق الذي يتم تحضيرة و هو يعتبر anticapsule .
– في حالات الميكروبات الموجبة لجرام تكون False positive يتم اضافة Sodium salicylate .

5- حقن الاطباق :
– يتم حقن المعلق من الميكروب المراد تعريفة في الاطباق
GN لجميع انواع البكتيريا الهوائية السالبة لجرام .
GP لجميع انواع البكتيريا الهوائية الموجبة لجرام .
AN لجميع انواع البكتيريا اللاهوائية.
YT لجميع انواع الخمائر .
FF لجميع انواع الفطريات الخيطية و بعض الخمائر
– يتم ترقيم الاطباق و كتابة البيانات عليها
– يتم صب المعلق في وعاء خاص
– يتم حقن الاطباق بواسطةMicropipette multi channel
– يتم غلق الاطباق بواسطة الغطاء الخاص بها .

6- تحضين الاطباق :
– يتم تحضين الاطباق في درجة الحرارة المناسبة ، و لمدة مناسبة حسب نوع الميكروب
يتم تحضين البكتيريا علي درجة حرارة 35م لمدة 20-24 ساعة و يتم تحضين البكتيريا الهوائية في جو رطوبة في حين انه في حالة الفطريات لا يفضل وجود الرطوبة و تحضن الاطباق علي درجة حرارة 26 م لمدة 5-7 أيام
– و يجب حقن الاطباق بمجرد فتحها و لا تترك فترة طويلة ( لا تزيد عن 5 دقائق ).
7- قراءة الاطباق :
– يتم قراءة الاطباق علي جهاز Micro station reader حيث يمكن قراءة الاطباق اما manually و يتم تسجيل النتائج علي الجهاز و بعد ذلك تتم القراءة و يتم تسجيل البيانات علي الجهاز و هي عبارة عن وقت التحضين ، رقم العزلة، نوع الاطباق ، نوع العزلة ، بعد ذلك يتم قراءة الاطباق و تتم مطابقتها مع قاعدة البيانات داخل الجهاز و يتم الحصول علي التعريف الكامل .
– و يمكن قراءة الاطباق بعد
4-6 ساعة بالنسبة للبكتيريا او بعد 18-24 ساعة
24-72 ساعة بالنسبة الخمائر
2-7 ايام بالنسبة الفطريات
– و بعد ذلك يتم الحصول علي Sheet التعريف مطبوع عليه البيانات كاملة
– و يمكن الحصول عليDendogram موضح به مدي قرابة الاجناس الاخري من الميكروب الذي تم تعريفة
– يتم غلق الاطباق بواسطة الغطاء الخاص بها